exon skipping

Het doel van exon skippen is om de genetische code te herstellen, zodat de goede eiwit bouwstenen weer kunnen worden gebruikt en er een deels functioneel dystrofine eiwit kan worden gemaakt. De achterliggende gedachte en aanpak staat in detail uitgelegd in het ‘achtergrond dmd‘ stukje. Exon skippen kan worden gebruikt om de genetische code te herstellen voor verschillende types mutaties (Welke type mutaties er allemaal zijn wordt beschreven in het stuk ‘Uitleg mutaties’).

Bijna alle onderstaande figuren bestaan uit 3 delen om de exon skip techniek duidelijk te kunnen uitleggen: bovenaan staat de situatie op DNA (gen) niveau, middenin staat de RNA copie voordat de intronen verwijderd worden (eventueel zijn een of meerdere exonen afgedekt door een AON). Onderaan staat de situatie op het niveau van het boodschapper RNA (de genetische code, met alle exonen aan elkaar geplakt).

Deleties

Bij de meeste deleties van een of meer exonen kan de genetische code worden hersteld door het skippen van één (Figuur 1) of twee (Figuur 2) exonen.

Figuur 1. In dit voorbeeld mist een patiënt exon 48-50. Omdat exon 47 en 51 niet op elkaar passen is de genetische code verbroken. Echter, exon 47 past wel op exon 52. In dit geval kan de genetische code dus worden hersteld door het skippen van exon 51.

Figuur 2. In dit voorbeeld mist een patiënt exon 46-50. Exon 45 en exon 51 passen niet op elkaar, dus de genetische code is verbroken. Echter het skippen van één exon kan de genetische code niet herstellen (exon 45 skippen werkt niet, want exon 44 past niet op 51, exon 51 skippen werkt ook niet, want exon 45 past niet op exon 52). Wanneer zowel exon 45 als exon 51 worden geskipt wordt de genetische code wel hersteld (exon 44 past op exon 52).

Kleine mutaties

Kleine mutaties kunnen leiden tot een vroegtijdig stopsignaal (stop mutaties) of de genetische code verbreken (door een kleine deletie of duplicatie binnen een exon). Met exon skippen kunnen ook deze mutaties worden omzeild (Figuur 3 en 4).

 

Figuur 3. Door een kleine mutatie is een vroegtijdig stopsignaal ontstaan in exon 49. Omdat exon 48 en exon 50 op elkaar passen, zal het skippen van exon 49 leiden tot het omzeilen van dit vroegtijdige stopsignaal, zonder dat de genetische code wordt verbroken.

Figuur 4. Door een kleine mutatie is een vroegtijdig stopsignaal ontstaan in exon 11. Exon 10 en 12 passen niet op elkaar, dus wanneer exon 11 wordt geskipt wordt het stopsignaal weliswaar omzeild, maar wordt ook de genetische code verstoord. Exon 10 past echter wel op exon 13, dus door het skippen van zowel exon 11 als exon 12 wordt het stopsignaal omzeild, terwijl de genetische code behouden blijft.

Duplicaties

Bij duplicaties in Duchenne patiënten wordt de genetische code verbroken omdat een of meerdere exonen dubbel aanwezig zijn. Dit compliceert het exon skippen omdat de AONs geen onderscheid kunnen maken tussen het originele exon en het gedupliceerde exon. Bij een duplicatie van één exon is het mogelijk de genetische code te herstellen met exon skippen (Figuur 5, 6 en 7). Voor duplicaties van meerdere exonen is exon skippen momenteel te gecompliceerd (Figuur 8, 9 en 10).

Figuur 5. Een duplicatie van exon 45. Omdat het extra exon 45 (wit-rood) niet op de originele exon 45 (blauw) past, is de genetische code verbroken. Wanneer echter OF het tweede gedupliceerde exon, OF het originele exon worden geskipt is de genetische code hersteld. Sterker nog: de normale genetische code is hersteld (er missen geen exonen). Dit is dus het meest ideale resultaat van exon skippen. Soms is exon skippen echter te efficient (Figuur 6). (Hoe efficient het exon skippen is, is lastig te voorspellen. Dit wordt eigenlijk pas duidelijk als AONs worden getest in gekweekte cellen van een patient).

Figuur 6. Wanneer bij een duplicatie van exon 45 de AONs te efficient zijn zullen zowel het origele als het dubbele exon 45 worden geskipt. Aangezien exon 46 niet past op exon 44 verstoort dit alsnog de genetische code.

Figuur 7. Als het skippen van één exon niet lukt (Figuur 6), dan kan de genetische code alsnog worden hersteld door naast de dubbele exons nog een derde exon te skippen (exon 44 in dit voorbeeld). Omdat exon 43 en 46 wel op elkaar passen, herstelt dit de genetische code. (Hier is het ook mogelijk om naast de exons 45 exon 46 te skippen: exon 44 past immers ook op exon 47).

Figuur 8. Exon skippen voor grote duplicaties is erg gecompliceerd. In dit voorbeeld zijn exon 44-48 gedupliceerd. Hierdoor wordt de genetische code verbroken van exon 44 past niet op exon 48. De genetische code kan worden hersteld door het gedupliceerde exon 44 te skippen. Echter, een AON gericht tegen exon 44 zal ook het originele exon 44 herkennen (Figuur 9 en 10), waardoor de genetische code wordt verbroken (het maakt hierbij niet uit of het dubbele exon al dan niet geskipt wordt).

Figuur 9. Het skippen van het originele exon 44 verstoord de genetische code, omdat exon 43 en exon 45 niet op elkaar passen.

Figuur 10. Ook wanneer beide exonen worden geskipt, wordt de genetische code verbroken.